產(chǎn)地 | 進(jìn)口、國(guó)產(chǎn) |
品牌 | 帛科 |
貨號(hào) | BKP6658 |
用途 | 公司產(chǎn)品僅用于科研 |
包裝規(guī)格 | 50T |
純度 | 詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)% |
CAS編號(hào) | |
是否進(jìn)口 | 是 |
概述:
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增,PCR產(chǎn)物不斷積累,熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加,這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè)?。通過(guò)對(duì)DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測(cè), 實(shí)現(xiàn)基因的相對(duì)定量、定量和定性分析。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
腸粘附性大腸桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | Enteroadhesive E.Coli(EAEC) | BKP6658 |
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性*的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
使用方法:
一、腸粘附性大腸桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品,必須設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢杂?/span>10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝)或第5號(hào)(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
10. 如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加)
熒光定量PCR服務(wù):
產(chǎn)品僅供科研使用簡(jiǎn)介:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
(03)請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計(jì)與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
(04)實(shí)驗(yàn)完成后,提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
小鼠凝血因子X(mouse FX) 作用: ELISA 規(guī)格: 48T/96T 進(jìn)口分裝 Menthyl-5-(4-amino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-[1,3]oxathiolane-2-carboxylic acid 147027-10-9 中文名: 分子式:C18H27N3O4S 度:98.0% 關(guān)鍵詞:
小鼠凝血因子X 英文名稱: blood coagulation factor X 規(guī)格: 48T/96T 英文縮寫(xiě): FX Nandrolone laurate 26490-31-3 中文名:月桂酸諾龍 分子式:C30H48O3 度:98.0% 關(guān)鍵詞:
小鼠凝血因子elisa試劑盒 小鼠凝血因子試劑盒 規(guī)格型號(hào):96T/48T 小鼠凝血因子試劑盒,規(guī)格型號(hào):96T/48T,來(lái)源:elisa試劑盒(進(jìn)口分裝),產(chǎn)品別名:小鼠凝血因子試劑盒、小鼠凝血因子elisa試劑盒 保存條件:2-8℃ 保質(zhì)期:6個(gè)月。 Ganciclovir 82410-32-0 中文名:更昔洛韋 分子式:C9H13N5O4
小鼠凝血因子Ⅹ(FⅩ)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝 Furosemide 54-31-9 中文名: 分子式:C12H11ClN2O5S
小鼠凝血因子Ⅹ(FⅩ)ELISAKit ELISA. 96T/48T Clorofene 中文名:4-氯-2-芐基苯酚 分子式:C13H11ClO
Mizolastine 108612-45-9 中文名:咪唑司汀 分子式:C24H25FN6O 度:98.0% 關(guān)鍵詞: 小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子 (mouse G-CSF) 作用: ELISA 規(guī)格: 96T 美國(guó) R&D
Mitiglinide calcium 145525-41-3 中文名:米格列奈鈣 分子式:C19H25NO3 度:98.0% 關(guān)鍵詞: 小鼠細(xì)胞蛋白(CC16)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Minoxidil 38304-91-5 中文名:米諾地爾 分子式:C9H15N5O 度:98.0% 關(guān)鍵詞: 小鼠可溶性壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(sAIL)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Minocycline 13614-98-7 中文名: 分子式:C23H28ClN3O7 度:98.0% 關(guān)鍵詞: 小鼠可溶性血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(sPECAM-1/sCD31)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Minisecolide C 1967030-77-8 中文名: 分子式:C28H34O7 度:% 關(guān)鍵詞: 小鼠可溶性細(xì)胞粘附分子1(sVCAM-1)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
可溶性ENG/sCD105 英文名稱: Human soluble Endoglin 規(guī)格: 48T/96T 英文縮寫(xiě): ENG/sCD105 Paroxetine 中文名:鹽酸帕羅西汀 分子式:C19H21ClFNO3
顆粒體蛋白Granulin 英文名稱: Granulin 規(guī)格: 48T/96T 英文縮寫(xiě): GRN 3-O-Acetylandrostenone hydrazone 122914-94-7 中文名:3-O-乙?;弁?/span> 分子式:C21H32N2O2
素‖受體︱型自身抗體 英文名稱: Angiotensin 2 Receptor 1 Aoaibodies 規(guī)格: 48T/96T 英文縮寫(xiě): AT1R-AA 3-Amino-4-methylbenzamide 中文名:3-氨基-4-甲基苯甲酰胺 分子式:C8H10N2O 度:98.0%
素‖受體︱型自身抗體 英文名稱: Angiotensin 2 Receptor 1 Aoaibodies 英文縮寫(xiě): AT1R-AA 規(guī)格: 48T/96T Ophiopogonin D 中文名:麥冬皂苷D 分子式:C44H70O16
抗酸性0酸酶(SACP)試劑盒(比色法) Repaglinide 135062-02-1 中文名:瑞格列奈 分子式:Repaglinide 度:98.0% 關(guān)鍵詞:
腸粘附性大腸桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒Ethyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-nitrobenzoate 136285-65-9 中文名: 分子式:C14H18N2O6 人抵抗素(Resistin)ELISAKIT ELISA. 96T/48T
Trenbolone cyclohexylmethylcarbonate 23454-33-3 中文名:群勃龍環(huán)己甲基碳酸酯 分子式:C26H34O4 人骨特異性堿性0酸酶B(ALP-B)ELISAKit ELISA. 96T/48T
Ceftiofur 103980-44-5 中文名:頭孢噻呋鹽酸鹽 分子式:C19H18ClN5O7S3 人骨鈣素/骨谷酸蛋白(OT/BGP)ELISAKit ELISA. 96T/48T
Cefquinome 84957-30-2 中文名:頭孢喹咪 分子式:C23H24N6O5S2 人阻抑素(PHB)酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒 Human PHB (Prohibitin) ELISA Kit
Stanozolol 10418-03-8 中文名:康力龍 分子式:C21H32N2O 人隱花色素1(CRY1)酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒 Human CRY1 (Cryptochrome 1) ELISA Kit
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無(wú)到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允?/span>DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4.PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi),并且要充分混勻。