產(chǎn)地 | 進(jìn)口、國產(chǎn) |
品牌 | 帛科 |
貨號 | BKP6915 |
用途 | 公司產(chǎn)品僅用于科研 |
包裝規(guī)格 | 50T |
純度 | 詳見說明書% |
CAS編號 | |
是否進(jìn)口 | 是 |
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
馬爾太蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | Marteilia spp. | BKP6915 |
概述:
產(chǎn)品僅供科研使用熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過程中,隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增,PCR產(chǎn)物不斷積累,熒光信號也會相應(yīng)的增加,這樣就可以通過熒光強(qiáng)度的變化來對PCR反應(yīng)進(jìn)行實時的監(jiān)測。本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性*的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
使用方法:
一、馬爾太蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)
1. 注意:產(chǎn)品僅供科研使用由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
10. 如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加)
熒光定量PCR服務(wù):
簡介:實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
(03)請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實驗,進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
(04)實驗完成后,提供完整的實驗報告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)。
實驗過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物??梢允?/span>DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。
大鼠肝細(xì)胞;BRL 3A革蘭氏染色液試劑盒(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)shēng huà shì jì容量:1米
HPAC細(xì)胞,人胰腺腺泡上皮癌 人舌癌細(xì)胞,T6細(xì)胞 雜交瘤(B類);C3110D2E11D-賴酸 D-Lysine (HPLC,≥98%) 923-27-3 1G 通用試劑
JEG-3(人細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2布洛芬相關(guān)物質(zhì)C Ibuprofqn Rqlctqd CoMpound C;4-isobutylccqtophqnonq 38861-78-8
Promocell C-25010 Hepatocyte Growth Medium, 肝細(xì)胞生長培養(yǎng)基(即用型) 500ml4,4-二羥基二本砜shēng huà shì jì容量:RT100克
人間充質(zhì)干細(xì)胞(骨髓)cDNAHMSC-bm cDNA迪克賽300Dexsi l300
ME-180(人子宮頸表皮癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2Ciprofloxacin環(huán)扶哌酸25克BR,20u/mg
Promocell C-23020 Fibroblast Growth Medium 2, 成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基2型(即用型) 500ml1,2-環(huán)氧-3-基丁烷 1,2-qPOXY-3-MqTHYLBUTcNq 1438-14-8
黃胸鼠;YCR芬那醋芬那醋 Mqfqncmic ccid 61-68-7
CD83 Others Rat 大鼠 CD83 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 溴化亞銅100克
人外周血白細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL23616-79-7芐基三丁基錄化銨Benzyltributylammonium chloride
F3 Others Human 人 Coagulation Factor III / Tissue Factor / CD142 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 熒光素Fluorescein質(zhì)量規(guī)格:AR
A172 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞鈣黃綠素Calcein質(zhì)量規(guī)格:IND
MCF-7-EGFP-puro(慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定株)人癌細(xì)胞 MCF-7-EGFP-puro (leiviral consuct stable sain) in human breast cancer cells 1640+10%FBS+1%P/S+2ug/ml puromycin瑞氏色素Wright's stain質(zhì)量規(guī)格:BS
RSPO1 Protein Human 重組人 R-Spondin 1 / RSPO1 蛋白吉氏色素,姬姆氏色素Giemsa stain質(zhì)量規(guī)格:BS
人 (HPF)( 5×105 ) mOPC, 小鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞 Mouse6-FAM, SE;6-羧基熒光素琥珀酯6-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester質(zhì)量規(guī)格:0.9
馬爾太蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒HA Others H5N1 甲型 H5N1 (A/Cambodia/S1211394/2008) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 醋酸鋰,二水(AR)Lithium acetate dihydrate質(zhì)量規(guī)格:>99%,AR
人腦內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL聚蔗糖400Ficol 400質(zhì)量規(guī)格:>98%,BR
BSC-1細(xì)胞,猴腎細(xì)胞系 CHRF(人巨核細(xì)胞) 敘利亞倉鼠腎細(xì)胞;BHK-21二硝基水楊酸3,5-Dinitrosalicylic acid質(zhì)量規(guī)格:>98%,BR
EFNA5 Protein Mouse 重組小鼠 Ephrin-A5 / EFNA5 蛋白 (His 標(biāo)簽)丙二酸鈉 malonate質(zhì)量規(guī)格:>98%
BC-022(人癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠漿細(xì)胞瘤;MPC-111酸二氫鈉二水 phosphate, monobasic, dihydrate質(zhì)量規(guī)格:>98.5%,分子生物學(xué)級