產(chǎn)地 | 進(jìn)口、國產(chǎn) |
品牌 | 帛科 |
貨號(hào) | BKP6925 |
用途 | 公司產(chǎn)品僅用于科研 |
包裝規(guī)格 | 50T |
純度 | 詳見說明書% |
CAS編號(hào) | |
是否進(jìn)口 | 是 |
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
擠奶工毒探針法熒光定量PCR試劑盒 | Milker's Nodule Virus(MNV) | BKP6925 |
概述:
產(chǎn)品僅供科研使用熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過程中,隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增,PCR產(chǎn)物不斷積累,熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加,這樣就可以通過熒光強(qiáng)度的變化來對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測。本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對(duì)DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實(shí)現(xiàn)基因的相對(duì)定量、定量和定性分析。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性*的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
使用方法:
一、擠奶工毒探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)
1. 注意:產(chǎn)品僅供科研使用由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品,必須設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽性對(duì)照),一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用10μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(hào)(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
10. 如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加)
熒光定量PCR服務(wù):
簡介:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
(03)請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計(jì)與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
(04)實(shí)驗(yàn)完成后,提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允?/span>DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。
LTEP-a-2細(xì)胞, 人喉表皮樣癌細(xì)胞,HEp-2細(xì)胞 tTA基因修飾的小鼠細(xì)胞(B類);Pan02-CAG-tTA-4C55-胞苷二嶙酸單鈉鹽shēng huà shì jì容量:100克
雜交瘤(B類);Z1510A2G6A2F8堿藍(lán)6B Alkali blue 6B 1324-80-7 10G 通用試劑
INSR Others Human 人 Insulin Receptor / INSR / CD220 ( Short Isoform ) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) D-2,3-二安基炳醋言醋鹽 H-D-DcP-OH HCL 6018-26-0
人葡萄膜色素細(xì)胞;UMpH10.0STANDARDpH標(biāo)準(zhǔn)液10.0生物技術(shù)級(jí)藍(lán)色無混濁溶液RTsigma
人氣管上皮細(xì)胞(HTEpiC)(5×105 )67-68-5二甲亞砜 99.7+%Dimetxyl sulfoxide
猴腎細(xì)胞;vero IgRCD4-N6-BenzoyladenineN-(5H-嘌呤-6-基)本甲先胺25克BR,98%
COL9A1 Others Human 人 COL9A1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 10-酰葉醋 10-ForMylfolic ccid 134-02-4
髓母細(xì)胞瘤組織源性原代細(xì)胞Many types of cells包裝:5 × 105方(1ml)/1ml棕櫚醋酯 Mqthyl PclMitctq 11-39-0
SW13細(xì)胞,人腎上腺皮質(zhì)瘤 人癌細(xì)胞,BT-549細(xì)胞 溶液AMSL-NorvalineL-2-基戊酸1克BR,99%
SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞;COS-734598-49-75-溴-1-茚酮5-Bromoindanone
A431細(xì)胞,表皮癌細(xì)胞系 人T細(xì)胞系,H9細(xì)胞 tTA基因修飾的小鼠(B類);P19-CAG-tTA-1D3銀杏內(nèi)酯C(標(biāo)準(zhǔn)品)Ginkgolide C質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品
BIU-87(人細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2銀杏內(nèi)酯J(標(biāo)準(zhǔn)品)Ginkgolide J質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品
CST5 Others Human 人 CST5 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 隱丹參酮(標(biāo)準(zhǔn)品)Cryptotanshinone質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品
中國倉鼠卵巢細(xì)胞(亞系克隆);CHO-HCV-NS4B隱丹參酮Cryptotanshinone質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥97%,BR
HA Others Influenza B 乙型 (B/Brisbane/60/2008) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) ?;蛆Z去氧膽酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Taurochenodeoxycholic acid質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品
擠奶工毒探針法熒光定量PCR試劑盒雜交瘤(B類);Z51B3C10H12A12G2F7B5 小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL醋甲唑胺(標(biāo)準(zhǔn)品)Methazolamide質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥99.0%,標(biāo)準(zhǔn)品
BRL 3A, 大鼠肝正常細(xì)胞 Rattus齊拉西酮Ziprasidone質(zhì)量規(guī)格:含量≥99%
IL1RAPL2 Others Human 人 IL1R9 / IL1RAPL2 / IL1 Receptor 9 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 塞曲司特/西拉達(dá)司/塞拉司特Seratrodast質(zhì)量規(guī)格:含量≥98.0%
人角膜細(xì)胞裂解物HKL美托拉宗Metolazone質(zhì)量規(guī)格:>99%,BR
CD86 Others Cynomolgus 食蟹猴 CD86 / B7-2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 美托拉宗(標(biāo)準(zhǔn)品)Metolazone質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥99.0%,標(biāo)準(zhǔn)品