產(chǎn)地 | 進口、國產(chǎn) |
品牌 | 帛科 |
貨號 | BKP7048 |
用途 | 公司產(chǎn)品僅用于科研 |
包裝規(guī)格 | 50T |
純度 | 詳見說明書% |
CAS編號 | |
是否進口 | 是 |
熒光定量PCR服務(wù):
簡介:實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實驗皆使用進口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
(03)請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料:DNA/RNA 來源等
2、產(chǎn)品僅供科研使用熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進行Real Time PCR實驗,進行實驗結(jié)果分析。
(04)實驗完成后,提供完整的實驗報告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準:
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
概述:
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中,隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增,PCR產(chǎn)物不斷積累,熒光信號也會相應的增加,這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監(jiān)測。本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
馬探針法熒光定量PCR試劑盒 | Parascaris equorum | BKP7048 |
使用方法:
一、馬探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?/span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(20 μL體系,在樣品制備室進行)
10. 如果只做1次重復,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復,則反應設(shè)置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加)
實驗過程:
產(chǎn)品僅供科研使用一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
4.PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性*的定量方法,已得到全世界的公認,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
T84人腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞 The cell T84 of human colon adenocarcinoma of lung metastasis D-MEM/F-12培養(yǎng)基+5%FBS2,3-吡嗪二羧酸(>98.0%(HPLC)(T))質(zhì)量規(guī)格:>98.0%(HPLC)(T)2,3-Pyrazinedicarboxylic Acid
VEGFA Protein Human 重組人 VEGF 183 / VEGF-A 蛋白茴香偶酰(>98.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格:>98.0%(GC)p-Anisil
小鼠腦膜細胞(MMC)(5×105) CNE1, 人細胞系 Human苯偶酰(>99.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格:>99.0%(GC)Benzil
兔晶體上皮細胞永生系;N/N1003A(RLE)苯偶酰 (區(qū)域精制法精制,熔段數(shù):22)質(zhì)量規(guī)格:Benzil Zone Refined (number of passes:22)
FAM3D Others Mouse 小鼠 FAM3D / Oit1 人細胞裂解液 (陽性對照) 吡哌酸(標準品)質(zhì)量規(guī)格:供檢查用Pipemidic acid
人腎透明細胞癌;Caki-1 大鼠海馬神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基 100mL鄰本二酸氫鉀shēng huà shì jì容量:2~8℃1克
P388 小鼠細胞N-乙酰-L-色酸 N-Acetyl-L-tryptophan,98% 1218-34-4 10G 通用試劑
SEMA4A Others Human 人 Semaphorin-4A / SEMA4A / Semaphorin-B 人細胞裂解液 (陽性對照) 三基典硅烷 Iodotrimqthylsilcnq 1609-98-4
非洲綠猴腎細胞;BS-C-1LB肉湯shēng huà shì jì容量:500毫升
人骨骼肌成肌細胞(HSkMM)(5×105)2273-43-0單丁基氧化錫Butyltin oxide
幼蚊細胞;C6/36鹽酸達克羅寧(標準品)Dyclonine hydrochloride質(zhì)量規(guī)格:含量測定
NLK Others Human 人 nemo-like kinase / NLK 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) SGI-1027SGI1027質(zhì)量規(guī)格:>98%,DNMT抑制劑
CL-0266LS 180(人腺癌細胞)5×106cells/瓶×2鹽酸溴己新(標準品)Bromhexine HCl質(zhì)量規(guī)格:含量測定
EPC, 大鼠內(nèi)皮祖細胞 非洲綠猴腎,BS-C-1細胞 hFOB 1.19(SV40 轉(zhuǎn)染成骨細胞)雷西莫特R848,Resiquimod質(zhì)量規(guī)格:>98%,TLR7/TLR8激動劑
人低侵襲性脈絡(luò)膜色素素瘤細胞;OCM-1A羥甲煙胺(標準品)N-(Hydroxymethyl)nicotinamide質(zhì)量規(guī)格:含量測定
馬探針法熒光定量PCR試劑盒人肺間充質(zhì)干細胞HPMSC吡嗪酰胺Pyrazinamide質(zhì)量規(guī)格:>99%,USP
REG4 Others Rat 大鼠 REG4 人細胞裂解液 (陽性對照) 阿魏酸,柏酸,反式阿魏酸Ferulic acid質(zhì)量規(guī)格:>99%,合成
大鼠食管平滑肌細胞完全培養(yǎng)基 100mL阿魏酸(標準品)Ferulic acid質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
A7r5 大鼠胸大動脈平滑肌細胞 A7r5 rat thoracic aortic smooth muscle cells 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%DMSO+20%FBS安石榴苷Punicalagin (40%)質(zhì)量規(guī)格:40%,BR
EGFL7 Protein Human 重組人 EGFL7 / VE-statin 蛋白 (His 標簽)安石榴甙(標準品)Punicalagin質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品